WB 實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣本制備
1、細(xì)胞收集
1.1、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞收集:去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,用預(yù)冷 PBS 清洗細(xì)胞 2 次,吸出 PBS。
1.2、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞收集:先 3000 轉(zhuǎn)/min 離心 5 分鐘收集細(xì)胞沉淀,再用預(yù)冷 PBS 輕輕吹打重懸,離心收集細(xì)胞沉淀。
1.3、組織樣本收集:用干凈的醫(yī)用剪剪碎目標(biāo)組織,使組織塊盡量小,此操作最好在冰上進(jìn)行,并且應(yīng)盡快完成,以防止樣品被蛋白酶降解。將組織用液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min,迅速用液氮研磨,研磨過程盡量控制在 1-2min 之內(nèi),以減少蛋白的降解。
2、總蛋白提取
2.1、細(xì)胞/組織裂解:對(duì)于細(xì)胞樣本,加入預(yù)冷的 RIPA 裂解緩沖液(含有 PMSF)(每 107 細(xì)胞/100 mm 培養(yǎng)皿/150cm2 培養(yǎng)瓶加入 1ml;每 5×106 細(xì)胞/60 mm 培養(yǎng)皿/75cm2 培養(yǎng)瓶加 0.5ml),冰上裂解 15min。
對(duì)于組織樣本,按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液,多次勻漿,直至組織完全勻漿,收集勻漿液。(裂解液中根據(jù)需要選擇添加或不添加蛋白酶抑制劑)。
2.2、離心
把裂解好的樣本置于于預(yù)冷的高速冷凍離心機(jī)中,12000rpm,10min。
2.3、蛋白變性
離心完成后,棄去沉淀,保存上清。吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度(BCA 法)測(cè)定。向剩余的蛋白提取液的離心管中加 5×Loading Buffer(最終工作液為 1X),95℃加熱變性 5min,待液體完全冷卻后置于-20℃分裝保存,避免反復(fù)凍融。
二、凝膠電泳
1、制膠及上樣:
1.1、配制分離膠,根據(jù)蛋白大小,選擇不同濃度的分離膠(見下表)混勻后注入預(yù)先按照好的制膠器中,其上加一薄層異丙醇封膠,室溫水平靜置 30min 至凝固。聚合后,可見在頂層異丙醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線。注意:防止氣泡注入;注膠前加入 TEMED,防止注膠前凝固;注入異丙醇時(shí)需沿玻板一邊緩慢拖動(dòng)加入。
1.2、待分離膠凝固后,傾去其上的異丙醇,以吸水紙吸凈殘余液體,緩緩加入配制好的濃縮膠至玻璃平板夾層, 將樣品梳沿玻板一端緩慢插入夾層的濃縮膠液體中,必要時(shí),再補(bǔ)加濃縮膠液體充盈剩余空間。室溫水平靜置 30min, 待膠完全聚合,凝膠時(shí)間視溫度而定。注意樣品梳與膠溶液間避免產(chǎn)生氣泡。
1.3、將凝膠固定于電泳裝置上,內(nèi)槽加滿電泳緩沖液,外槽沒過底部 3-5cm 即可。雙手垂直拔出樣品梳。
1.4、用移液槍吸取樣品垂直梳孔上樣。成分很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物需加 100~200μg,而成分較少的樣本只需 1-50μg 蛋白量。對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品,如有空置的加樣孔,須加等體積的空白 1×Loading Buffer,以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。
分離膠濃度的選擇:
分子量( kDa) | 分離膠濃度 |
X≤10 | 15% |
10<X≤15 | 13.5% |
15<X≤25 | 12% |
25<X≤35 | 11% |
35<X≤40 | 10% |
40<X≤55 | 9% |
55<X≤70 | 8% |
70<X≤100 | 7% |
100<X | 6% |
2、電泳(采用恒壓)
2.1、接通凝膠電泳儀的電源,先在 80V 下電泳至溴酚藍(lán)染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠。(約 30 分鐘)
2.2、提高電壓至 120V,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。
三、轉(zhuǎn)膜
1.1、從玻璃板中取出凝膠,在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序,將其浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。
1.2、取與膠同樣大小的 NC 或 PVDF 膜,NC 膜用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡 5 分鐘以上待用,PVDF 膜需要先放入甲醇中浸泡5-10 分鐘,再放入轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡。
注意:目的蛋白分子量大于 20kDa 選擇 0.45μm 的NC 膜,小于 20kDa 選擇 0.2μm 的NC 膜或 0.22μm 的PVDF 膜。
1.3、按從負(fù)極到正極順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)依次放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、三層濾紙、凝膠、膜、三層濾紙、海綿,保證每層之間沒有氣泡。
1.4、將轉(zhuǎn)移夾放入預(yù)先加滿轉(zhuǎn)移緩沖液的轉(zhuǎn)移槽中,膜在正極、膠在負(fù)極,整個(gè)轉(zhuǎn)移槽放置入冰水浴中,按照下表?xiàng)l件進(jìn)行電泳。
注意:事先裁剪濾紙和膜,1 張膜和 6 張濾紙??磕ひ粋?cè)濾紙可裁剪稍小些,以防與另一側(cè)濾紙邊緣連接形成短路。轉(zhuǎn)膜條件的選擇:
分子量( kDa) | 轉(zhuǎn)膜條件 |
X≤10 | 恒流 200mA, 30min |
10<X≤15 | 恒流 200mA, 40min |
15<X≤20 | 恒流 200mA, 50min |
20<X≤50 | 恒流 200mA, 1kDa/min+20min |
50<X≤100 | 恒流 200mA, 1kDa/min+30min |
100<X≤150 | 恒流 250mA, 1kDa/min+20min |
150<X≤180 | 恒流 270mA,1kDa/min |
180<X | 恒流 270mA,1kDa/min |
四、封閉
把膜取出后放入合適孵育容器中,加入 5%脫脂奶粉/TBST,室溫?fù)u動(dòng)孵育 1 小時(shí)。
五、抗體孵育
1、一抗孵育:直接將一抗加入封閉液中進(jìn)行適當(dāng)稀釋,室溫 2h 或 4℃振搖孵育過夜;
2、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次;
3、二抗孵育:二抗用 TBST 稀釋,室溫下振搖孵育 1h;
4、以 TBST 洗膜,5 分鐘 x 4 次。
注意:清洗換液過程中應(yīng)避免膜干掉,否則會(huì)產(chǎn)生非特異背景。
六、曝光
1、根據(jù)膜的大小,按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液,將 ECL 試劑盒中的 A、B 組分按 1:1 的比例混合,配置成發(fā)光檢測(cè)工作液。
2、用鑷子取出膜,膜下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余液體,將工作液加到膜上,室溫孵育 1-2min,此步驟可在潔凈保鮮膜上完成。
3、壓片檢測(cè):將膜固定于片夾內(nèi),暗室壓片 1 分鐘,立即顯影定影,根據(jù)結(jié)果調(diào)整壓片時(shí)間,或直接分別壓片 30s、1min、3min、5min,然后一起顯影定影觀察結(jié)果。
4、熒光成像儀檢測(cè):將膜放到熒光成像儀內(nèi),參考儀器說明書進(jìn)行檢測(cè)。